Иммуногистохимия: для чего она проводится

Как работает метод

В названии метода соединились три отрасли – иммунология, гистология и химия. Для анализа используют химические вещества. Реактивы насыщены антителами, находящими раковые антигены. Антитело – это белок, его структура притягивает антиген. Белок окрашивают ферментами, красителями, которые проявляются при положительной реакции.

Теоретические основы иммуногистохимии заложены в 40-е годы 20-го века. С помощью флуоресценции находили антигены в замороженных клетках. Затем стали использовать окрашенные ферментами антитела. Установили соответствия цветовой реакции и типа раковых клеток. Также определили гормоны и их рецепторы.

Практическое применение методов ИГХ:

• Определение типа клеток;
• Изучение секреторных внутриклеточных процессов и особенностей клеточного синтеза;
• Определение гормонов и гормональных рецепторов.

Клетки под микроскопом после иммуногистохимии
Виды:

• Прямой метод – маркированные антитела соединяются с искомыми антигенами.
• Непрямой, «антиген-антитело» – неотмеченные антитела находят антигены, потом их соединения обнаруживают вторичные отмеченные антитела.

Цвет реакции показывает статус опухоли.

Что такое иммуногистохимия

Иммуногистохимия (ИГХ) – это метод локализации специфических антигенов в тканях, основанный на распознавании антигена соответствующим антителом и выявления результатов этого связывания на светооптическом уровне.

История ИГХ началась в 1940-х годах, когда Coons с соавторами разработали технику иммунофлуоресценции для выявления антигенов в замороженных срезах. Позже были разработаны и внедрены антитела, меченые не флуоресцентными красителями, а ферментами. Нанесение ферментной метки (пероксидаза хрена) на антитело, открытое Avrameas и Nakane с последующим воздействием визуализирующей системы, позволило увидеть окрашенный продукт реакции отмеченного антитела в световой микроскоп. Таким образом стало возможным идентифицировать клетки различных типов по их уникальным признакам (маркерам). Кроме того, метод позволил выявлять гормоны и рецепторы к ним, а также изучать синтетические и секреторные процессы.

Метод получил широкое распространение в диагностической патологии только в 1990-х. Taylor и Burns первыми успешно продемонстрировали метод на фиксированной в формалине заключенной в парафин ткани (т.е. на гистологических препаратах, приготовленных стандартным способом).

Существуют различные способы проведения реакции. Так, наиболее часто используют прямой метод, при котором маркированные антитела антитела связываются непосредственно с выявляемым веществом. Более чувствительным является непрямой метод, основанный на том, что немаркированные первичные антитела связываются с искомым антигеном, а затем обнаруживаются при помощи вторичных меченых антител.

Для повышения чувствительности метода начали использовать многоступенчатую визуализацию (пероксидазно-антипероксидазный, авидин-биотиновый, биотин-стрептавидиновый метод) и в итоге были разработаны высокочувствительные “полимерные” методы амплификации.

С момента внедрения метода в диагностическую практику, его применение значительно расширилось, иммуногистохимическое исследование перестало быть предметом только научных исследований. ИГХ стало существенным компонентом процесса постановки диагноза и классификации опухоли. Кроме того, с помощью ИГХ стало возможным прогнозировать дальнейшее биологическое поведение заболевания, определять возможности таргетной терапии, резистентность и чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии.

Иммуногистохимическое исследование является очень важной частью верификации диагноза. Особенно актуальным имуногистохимическое исследование является для диагностики лимфом (в подавляющем большинстве случаев диагноз без ИГХ поставить невозможно), рака молочной железы, простаты, опухолей мягких тканей, для определения гистологической принадлежности недифференцированных опухолей и метастазов из невыясненного первичного очага.

ИГХ исследование выполняется после гистологического исследования окрашенных гематоксилином и эозином препаратов. После оценки изменений патолог интерпретирует полученную информацию и только на этом этапе назначает панель анител, применимую специально для опухолей данного гистологического типа. Обычно для постановки диагноза используется несколько антител, так как важными являются не только положительные, но и отрицательные окраски. Иногда проводится один или несколько дополнительных этапов исследования. В результате гистологическое строение опухоли сопоставляется с совокупностью полученных результатов и на основании этого выставляется окончательный диагноз.

Длительность проведения ИГХ исследования зависит от метода (вручную либо с помощью специальных аппаратов для автоматической окраски) и составляет от суток до нескольких дней, а иногда и недель. Кроме того, необходимо учитывать время, затрачиваемое патологом на интерпретацию полученных данных.

Еще одним очень важным нюансом является стандартизация и воспроизводимость результатов ИГХ исследований. Так как ИГХ – это сложный и многоступенчачтый процесс, то существует огромное количество факторов, влияющих на результат. Техническая ошибка, низкое качество реагентов, нарушение фиксации проводки и/или фиксации биологического материала, неправильно выбранная панель антител, неверная интерпретация материала — всё это может привести к неверным или неполным результатам исследования. Именно поэтому желательно проведение важных исследований в хорошо оснащённых (автоматизация снижает влияние “человеческого фактора”) лабораториях с опытным персоналом.

Цель метода

Иммуногистохимическое исследование отвечает на три вопроса.

Что это такое

Специфический анализ помогает выяснить строение раковой клетки и идентифицировать по гистологическим признакам, к какому классу относится новообразование.

Где оно находится

Если точная локализация опухоли неизвестна, с помощью иммуногистохимии находят расположение по метастазу.

Как это лечить

С помощью анализа видна реакция антигенов на вещества препаратов химиотерапии. Так удаётся оценить, окажется ли действенным лечение указанным способом. Установить, к каким препаратам рак устойчив, можно прежде, чем химия попадет в организм человека. Таким образом, пациента избавляют от лишней интоксикации, а сразу назначают лекарство, о действенности которого заведомо известно. Если рак устойчив к химиотерапии, предстоит выбрать другой метод лечения.

Это помогает в лечении эстрогенозависимых опухолей при раке молочной железы.

Сложная структура железистых клеток включает признаки новообразований различной степени агрессивности. Эти опухоли бывают устойчивыми к химиотерапии и гормонам. Насколько агрессивно развивается опухоль, возможно установить по маркеру пролиферации в иммуногистохимическом тесте.

Зачем применяют иммуногистохимическое исследование

Множество ученых по всему миру подтвердили наличие ряда определенных факторов в опухолях, которые напрямую связаны с прогнозированием онкологического заболевания и ответом на соответствующее лечение.

К таким факторам принадлежат:

• Рецепторы к женским половым гормонам;
• Маркеры активности онкологического процесса;
• Чувствительность к противоопухолевым средствам;
• Сосудистый фактор роста опухоли.

При проведении обычного гистологического исследовании при подозрении на рак грудной железы, невозможно обнаружить такие характеристики, которые может содержать в себе опухоль, поэтому иммуногистохимия рака молочной железы имеет существенное преимущество, перед другими методами исследования.

Как проходит процедура

На иммуногистохимический анализ попадает образец ткани, взятый с помощью биопсии. Это способ забора биоматериала с помощью тонкой иглы. Её вводят в тело пациента и шприц-системой втягивают ткань опухоли. Образец проходит подготовку:

• Фиксация с помощью парафина.
• Изготовление срезов.
• Распределение срезов по стеклам.
• Обработка образцов антителами и красителями.

Перед исследованием биоматериал хранится в формалине. Это позволяет использовать единственный образец долгое время, чтобы не травмировать пациента. Биопсия бывает болезненна, если опухоли расположены в труднодоступных местах. Злокачественные образования в головном мозге по возможности удаляют оперативно, на анализ попадает непосредственно опухоль. Важно сохранить материал, так как опухоли бывают размером до 1 см. По результатам теста строится программа лечения. Впрочем, в этом случае иммуногистохимия обладает преимуществом.

Работа с материалом биопсии

Суть исследования

Иммуногистохимический тест заключается в исследовании клеток ткани опухоли, которое проводится с помощью специальных реактивов. Эти реактивы содержат антитела – специфические белки, меченые определенными веществами, которых можно детектировать (например, флуоресцентные красители, ферменты, коллоидное золото и другие).

Антитела имеют специфическую пространственную структуру, которая позволяет им связываться с антигеном – искомым веществом в опухолевых клетках. Такая химическая реакция называется «антиген-антитело», и указывает на наличие специфических для опухоли веществ во взятом образце.

В частности, в ходе иммуногистохимического исследования могут искать некоторые рецепторы к гормонам (например, эстрогену, прогестерону и другим), онкологические маркеры, маркеры усиленного роста раковых клеток и другие антигены.

В клинической практике чаще всего применяется метод непрямой иммуногистохимии, когда антигены, полученные из ткани пациента, связывают с первичными антителами. Так получается комплекс «антиген-антитело», к которым прикрепляют вторичные антитела. Такой комплекс можно окрасить специальными красителями, и по выраженности окраски специалисты оценивают статус опухоли.

Положительные и отрицательные стороны

Преимущества метода:

• Требуется минимум биоматериала и реактивов;
• Определяет рак на ранней стадии;
• Быстрый результат;
• Точность и достоверность.

Дополнительное преимущество – в возможности трехмерного моделирования. Ответная реакция на антитела видна через три часа. Окончательное заключение дается через 7-10 дней. По истечении этого времени будет точно установлен тип рака и стадия заболевания, а также его первичный очаг. Изменение цвета маркеров обычно не имеет разночтений при постановке диагноза. На итоговом бланке прописывают расшифровку результатов.

Достоверность зависит от метода окрашивания образца реактивами. Это делается автоматически и вручную. При ручном методе не исключён человеческий фактор, ошибки лаборантов. Лечащий врач подскажет, в какую лабораторию обратиться. Пациент может самостоятельно поинтересоваться, как проводится анализ в конкретном учреждении. Для достоверности результата он может проводиться повторно или в двух лабораториях.

Погрешность в результате возникает по вине пациента. Перед биопсией следует отказаться от гормональных препаратов и других лекарств, от физических нагрузок, придерживаться диеты. Внешние факторы влияют на результаты.

Применение метода в диагностике

Показания к анализу:

• Патологии репродуктивной системы, бесплодие;
• Активный опухолевый рост любой локализации.

Противопоказаний к анализу нет. Порой невозможно получить биоматериал для исследования из-за расположения опухоли.

Иммуногистохимия эндометрия – важное исследование для нахождения причин бесплодия. Его цель – найти антиспермальные клетки, препятствующие оплодотворению. Причиной бесплодия становится нечувствительность эндометрия к гормонам во время овуляции. При этом показатели гормонального фона в норме, антиспермальных тел нет. Иммуногистохимическая диагностика выявляет, что проблема в рецепторах эндометрия.

Трудно поддаются диагностике тимомы. Их деление на злокачественные и доброкачественные условно. Всё зависит от конкретного случая. Статус опухоли вилочковой железы, тимуса показывает исследование на антитела.

ИГХ при раке прямой кишки применяется, чтобы установить эпителиальный или эндокринный характер опухоли, наследственный фактор и прогноз. Методика определяет первичное ли заболевание и метастазы.

Расшифровка результатов основана на показателе степени злокачественности. Чем он выше, тем менее благоприятный прогноз. Патология – 85% содержания маркера, означает последнюю стадию заболевания с метастазами. Менее 10% – норма, благополучный исход лечения.

Другие маркерные методы

Онкологический диагноз всё же редко ставят по результатам единственного исследования.

Гистологический

Второй информативный анализ – гистология. Метод отличается от иммуногистохимии тем, что даёт представление только о клеточном строении. Гистологическим способом выделяют в одном материале несколько различных структур, к примеру, аденокарциномы. Злокачественное образование формируется из железистой ткани, которое выделяет жидкость. Исходя из типа жидкости, выделяют серозную и слизисто-секреторную. Клетки аденокарцином располагаются фолликулярно или папиллярно. Опухоль бывает твердой или с включениями цист, и уже классифицируется как цистаденокарцинома. Об этих характеристиках узнают по результатам гистологического исследования и корректируют лечение под конкретный тип опухоли.

Технология такая же, как при иммуногистохимии. Берут материал с помощью биопсии, покрывают парафином и разрезают образец на тонкие пластины. Готовые препараты также окрашивают, после чего патоморфолог изучает их под микроскопом.

Недостатки гистологического исследования – длительные сроки ожидания результата планового анализа, 10-14 дней. Срочный анализ делают за 30 мин.

Окрашенный препарат для изучения

Метод МГМ

Ещё один анализ, в основе которого лежит реакция на маркеры – молекулярно-генетический. Помогает установить отклонения в ДНК злокачественной опухоли, влияющие на её метастатическую и инвазивную активность, а также наличие наследственной предрасположенности или спорадической, спонтанной природы образования.

Гистология и иммуногистохимия – два основных метода постановки диагноза при раке, подтверждающие друг друга. Разница в результатах редка, так как иммуногистохимия включает исследование клеточного строения.

Часто после гистологического исследования лимфоузла пациента дополнительно направляют на иммуногистохимию. Под микроскопом материал изучает эксперт, который может что-то упустить. Либо структуру сложно идентифицировать. Метод ИГХ – помощь в спорной ситуации.